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    細胞培養的注意事項


    養好細胞注意點

    (一)冷凍管應如何解凍 

    取出冷凍管后,須立即放入37 ℃ 水槽中快速解凍,輕搖冷凍管使其在1分鐘內全部融化,并注意水面不可超過冷凍管蓋沿,否則易發生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時,必須注意**,預防冷凍管的爆裂。

    (二)細胞冷凍管解凍培養時,DMSO如何處理

    在細胞解凍之后,可直接離心去除DMSO,用新鮮的培養基懸浮后直接放入含有 新鮮培養基的培養角瓶中進行細胞培養,如此可避免解凍后細胞生長受到DMSO影響。

    (三)可否使用與原先培養條件不同的培養基

    每一細胞株均有其特定使用且已適應的細胞培養基,若驟然使用和原先提供培養條件不同的培養基,細胞大都無法立即適應,造成細胞無法存活,不應該馬上替換。

    (四)可否使用與原先培養條件不同的血清種類

     血清是細胞培養上一個極為重要的營養來源,所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產生極大的影響。來自不同物種的血清,在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同,血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。

    (五)何謂 FBS,FCS,CS,HS

    FBS (fetal bovine serum) 和 FCS (fetal calf serum) 是相同的意思,兩者都是指胎牛血清。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。

    (六)培養細胞時應使用 5% 或 10% CO2

    一般培養基中大都使用 HCO3-/CO32-/H+ 作為 pH 的緩沖系統,而培養基中 NaHCO3 的含量將決定細胞培養時應使用的 CO2 濃度。理論當培養基中 NaHCO3 含量為每公升 3.7 g 時,細胞培養時應使用 10% CO2;當培養基中 NaHCO3 為每公升 1.5 g 時,則應使用 5% CO2 培養細胞。

    (七)何時須更換培養基。培養基中是否須添加***。

    視細胞生長密度而定,或遵照細胞株基本數據上的更換時間,按時更換培養基即可。

    一般正常培養狀態下,培養基中可以添加***。 按1%體積分數加入雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素),使青霉素和鏈霉素的終濃度分別為100 U/mL和100 μ/mL。

    (八)貼壁細胞傳代時所使用的 trypsin-EDTA 濃度及相應處理

    一般使用的 trypsin-EDTA 濃度為 0.25% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。**次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中,保存于 –20 ℃,避免反復冷凍解凍造成 trypsin 的活性降低,并可減少污染的機會.。

    (九)將一般動物細胞離心下來,離心速率多少

    回收動物細胞,其離心速率一般為 1 000 rpm,5~10 分鐘,過高的轉速,將造成細胞死亡。

    (十)細胞的接種密度

    依照細胞株基本數據上的接種密度或稀釋分盤的比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長的重要原因之一。

    (十一)細胞冷凍培養基的成分及DMSO的等級

    動物細胞冷凍保存時*常使用的冷凍培養基是含 5~10% DMSO (dimethyl sulfoxide) 和 90~95 % 原來細胞生長用的新鮮培養基均勻混合。注意:由于 DMSO 稀釋時會放出大量熱能,故不可將 DMSO 直接加入細胞液中,必須使用前先行配制完成。冷凍保存使用的 DMSO 等級,必須為 Tissue culture grade 的 DMSO ,其本身即為無菌狀況,**次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中避光保存。

    (十二)冷凍保存細胞的方法及冷凍細胞濃度

    將貼壁細胞消化后離心收集,懸浮細胞直接離心收集,以含有DMSO完全培養基或胎牛血清的凍存液重懸細胞至終濃度約1x106/ml。。以每管1~2ml分裝至凍存管中。用絕熱材料包裹置-70攝氏度冰箱冷凍過夜。次日保存到液氮中。 

    冷凍管內細胞數目一般為 1x106 cells/ml vial,融合瘤細胞則以 5x106 cells/ml vial 為宜。


    (十三)如何避免細胞污染

    細胞污染的種類可分成**、**、霉菌、病毒等。主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環境不佳、污染的血清和污染的細胞等。嚴格無菌操作技術、清潔的環境、與品質良好的細胞來源和培養基配制是減低污染的*好方法。

    (十四)支原體 (mycoplasma)污染的細胞, 對細胞培養有何影響

    不能以肉眼觀察出支原體污染異狀。除極有經驗的專家外,大多數遭受支原體污染的細胞株,無法以其外觀分辨。

    支原體污染幾乎可影響所有細胞的生長參數,代謝及研究任一數據。故進行實驗前,必須確認細胞為 mycoplasma-free,實驗結果的數據方有意義。

    (十五)培養基保存于 4 ℃ 冰箱中,顏色會偏暗紅色,且 pH 值會越來越偏堿性

    培養基保存于 4 ℃ 冰箱中,培養基內的 CO2 會逐漸溢出,造成培養基越來越偏堿性,而培養基中的酸堿指示劑 (通常為 phenol red)的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養基偏堿的結果,將造成細胞生長停滯或死亡。若培養基偏堿時,可以通入無菌過濾 CO2 ,以調整 pH 值?;蛩釅A調PH。

    (十六)L-谷氨酰胺在細胞培養中重要嗎?它在溶液中不穩定嗎?

    L-谷氨酰胺在細胞培養時是重要的。脫掉氨基后,L-谷氨酰胺可作為培養細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經過一段時間后會降解,L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成,而氨對于一些細胞具有毒性。

    (十七)什么培養基中可以省去加酚紅?培養基中丙酮酸鈉的作用是什么?

    酚紅在培養基中被用來作為 PH 值的指示劑:中性時為紅色,酸性時為黃色,堿性時為紫色。由于酚紅干擾檢測,一些研究人員在做流式細胞檢測時,不使用加有酚紅的培養基。

    丙酮酸鈉可以作為細胞培養中的替代碳源,盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源,但是,如果沒有葡萄糖的話,細胞也可以代謝丙酮酸鈉。

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